RNA提取純化的注意事項(xiàng)

由于RNA酶的廣泛存在與難以滅活的頑固特性。使得RNA的提取純化和后續(xù)工作變得非常困難。

1. RNases 是非常穩(wěn)定和活躍的一種酶，一般不需要輔助因子的功能，因而在實(shí)驗(yàn)室內(nèi) RNA 很容易被降解
2. 如果不預(yù)先消除可能的 RNase 污染，請(qǐng)不要使用任何塑料制品或玻璃制品
3. 純化的 RNA 溶解在 RNases-free 的水中，在 –20℃或 –70℃進(jìn)行儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)一年不會(huì)引起 RNA降解

    對(duì)于使用 RNeasy Kit 進(jìn)行 RNA 純化，一般不要求額外的 DNase 消化過程，這是因?yàn)?QIAGEN的 RNeasy 硅膠膜技術(shù)能夠高效去除大部分的 DNA。然而，對(duì)于某些基于 RNA 的敏感應(yīng)用，我們建議同時(shí)使用 RNase-free DNase Set（操作流程可以參見 RNeasy 產(chǎn)品說明書）對(duì) DNA 進(jìn)行消化，確保得到的 RNA 無任何 DNA 的污染。

     RNA工作的主要問題是防止RNA酶的污染。除了操作時(shí)需要注意RNA酶，那么針對(duì)不同類型的樣本，進(jìn)行RNA純化時(shí)有哪些需要注意的地方呢？

從富含纖維的組織中分離 RNA（如心臟或肌肉組織等）有一定難度，這是因?yàn)槔w維組織中的收縮蛋白，結(jié)締組織，膠原等成分都會(huì)干擾 RNA 的純化過程。所以為了去除這些蛋白的影響，組織樣本需要用含有蛋白酶或含酚的裂解液。同時(shí)上述處理?xiàng)l件不能引起 RNA 降解，QIAGEN 推薦使用 RNase-free proteinase K 進(jìn)行消化。

固定和包埋的過程能導(dǎo)致核酸的嚴(yán)重降解和化學(xué)修飾，通常我們從 FFPE 樣本中純化得到的核酸的分子量要小于新鮮或冰凍組織。核酸降解/片段化的程度依賴于樣本類型和年齡，另外和固定，包埋和儲(chǔ)存條件也有很大關(guān)系。

請(qǐng)依照以下建議進(jìn)行 FFPE 樣本的處理，以減少對(duì) RNA 的損傷

• 盡快取出組織樣本并進(jìn)行固定
• 組織樣本的厚度不要超過 5 mm，固定時(shí)間不要超過 24 小時(shí)
• 使用高質(zhì)量試劑進(jìn)行石蠟包埋，不要使用添加劑
• 如果可能的話，避免對(duì)樣本進(jìn)行染色
• 儲(chǔ)存 FFPE 樣本的條件要合適，如在 4 度進(jìn)行存放長(zhǎng)達(dá) 1 年，仍可純化到高品質(zhì) RNA
• 使用合適的脫蠟溶液進(jìn)行脫蠟處理
• 在 RNA 純化過程要有逆轉(zhuǎn)交聯(lián)的步驟，便于大程度釋放 RNA 分子
• 去除基因組 DNA 的污染

全血中紅細(xì)胞沒有細(xì)胞核，每毫升血液中實(shí)用細(xì)胞數(shù)少，核酸得率比較低，所以從全血中分離的目標(biāo)是白細(xì)胞。此外，還必須除去污染物如抗凝劑肝素和 EDTA 以及天然存在的酶抑制劑，這些物質(zhì)都會(huì)干擾下游的 RNA 分析。QIAamp RNA Blood Kits 高度適合從人血液樣本中純化高品質(zhì)RNA，能消除 RNases，污染物和酶抑制劑，同時(shí)大程度去除基因組 DNA 的污染。

RNA 尤其是 miRNA 可在血清，血漿，尿液和其他體液中存在，并且也存在于細(xì)胞培養(yǎng)液的上清液中。胞外 RNA 的含量比胞內(nèi) RNA 要低的多，但是它相對(duì)穩(wěn)定，在人全血中的半衰期約為 2天。然而，多次反復(fù)凍融仍然會(huì)導(dǎo)致純化效果變差。推薦純化過程中使用 carrier RNA 來提高游離 RNA 的回收效率。

一些病毒具有單鏈或雙鏈 RNA 基因組。病毒 RNA 通常是分離自無細(xì)胞體液中，而這些樣本中病毒核酸的含量非常低。 病毒顆?？赡苄枰ㄟ^超速離心，超濾或沉淀的方式進(jìn)行濃縮。推薦純化過程中使用 carrier RNA 來提高游病毒 RNA 的回收效率。另外推薦使用合適的逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)某些含有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的病毒核酸進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。